放线菌BAC文库构建

放线菌是次级代谢产物的主要来源，目前发现的所有来源于微生物的抗生素超过一半是放线菌产生的。放线菌可产生种类繁多的天然产物，具有丰富多样的化学结构和生物活性，成为科学家近几十年来研究的热点。基因组测序发现在放线菌基因组中存在大量的天然产物生物合成基因簇（30-140kb），目前通常使用cosmid载体和Fosmid载体系统（30-40kb）来进行文库的构建和基因克隆，而针对很多大于60kb的I型聚酮合酶基因簇和非核糖体多肽合成酶基因簇，需要采用承载能力更大的BAC载体（100-300 kb）(Meizhong Luo and Rod A. Wing 2003)和PAC载体系统克隆完整的基因簇，进行大规模的异源表达和筛选，用以寻找新的天然产物的生物合成基因。2016年Xu Min开发了一种基于BAC文库的异源表达和功能筛选分析系统（LEXAS，见图1）。

LEXAS文库（文库表达分析系统）的表达和分析示意图：


Figure 1. Schematic representation of the LEXAS library expression and analysis procedure (Min. Xu et al. 2016).

链霉菌整合型BAC载体

链霉菌整合型BAC载体既有BAC载体外源片段承载能力大、稳定性好、无嵌合体和操作简便等优点，又包含有安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP 等元件，能通过接合转移和原生质体转化的方法导入链霉菌模式菌株，并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。

常见的链霉菌整合型BAC载体有pHZAUBAC-AS（杨学等未发表资料）、pMSBBACs(黄胜 et al. 2012; 李娜 et al. 2015; 张怡 et al. 2015)、pStreptoBAC-V(Zhiyang. Feng et al. 2009)、pHL921系列(郭航 et al. 2012)和pESAC13(Adam. C. Jones et al. 2013)等。

pIndigoBAC536-S载体：

pIndigoBAC536-S(Xue. Shi et al. 2011) 是高效的BAC载体，广泛应用于动物、植物、微生物的基因组BAC文库构建。阿维菌素（Avermectins）(Qian Deng et al. 2017)和哦啊多杀菌素（Spinosad）(Gao. Yi. Tan et al. 2017)等的生物合成基因簇都是从pIndigoBAC536-S 载体构建的BAC文库中筛选得到的。通过构建阿维链霉菌和糖多孢菌的基因组BAC文库，筛选出包含完整基因簇的阳性BAC克隆，在阳性克隆载体骨架上导入安普拉霉素抗性标记、oriT、φC31、attP和aac(3)IV元件，在链霉菌中完成了阿维霉素（图2，整合了阿维霉素基因簇的BAC载体物理图谱）和哦啊多杀菌素的异源生物合成。面对复杂结构天然产物合成效率低的问题，刘天罡老师课题组采用天然产物的异源合成到蛋白组学和代谢组学方法为指导的生物合成模块优化策略，实现了哦啊多杀菌素生物合成效率的提高（图3）。


Figure 2. Physical map of BAC recombinant 14F9S derived from pIndigoBAC536-S(Qian Deng et al. 2017).

Figure 3. Workflow of the omics analysis guided natural product heterologous production in genome mining (Gao. Yi. Tan et al. 2017).

pMSBBACs载体：

华中农业大学何璟教授开发的pMSBBACs载体是以pCUGIBAC1(Meizhong Luo and Rod A. Wing 2003)为基础载体，通过引入pSET152载体（pJTU2554）(Li. Li et al. 2008; Shan. Wang et al. 2012)的oriT、φC31、attP和aac(3)IV得到的能直接用于链霉菌整合的新载体，该载体综合了传统BAC载体的高稳定性和链霉菌整合型载体的优势。

pMSBBACs载体具有以下优点：（1）pMSBBACs的空载体含有大肠杆菌高拷贝质粒的复制子，方便获得大量的载体DNA；（2）切除pMSBBACs载体的高拷贝区段得到单拷贝的pHS002载体，含有φC31整合酶基因及attP位点，用pHS002载体克隆的外源大片段DNA可通过位点特异性整合插入目标宿主染色体中稳定保留下来；（3）含有安普拉霉素抗性标记，在大肠杆菌和链霉菌中都可以进行筛选；（4）带有转移起始位点（oriT），可以在转移功能区（transfer）的帮助下通过接合转移将大片段DNA从大肠杆菌转移到链霉菌中去。接合转移系统可以避开链霉菌严格的限制系统，操作比较简单，且转移频率受DNA大小影响幅度较小，更利于大片段DNA的操作(黄胜 et al. 2012)。

pHZAUBAC-AS载体：

pMSBBACs 载体克隆位点两端用于分析和释放DNA插入片段的酶切位点是NotI（GCGGCCGC），由于链霉菌基因组GC含量高，用NotI酶切产生大量小片段条带，不利于BAC文库质量检测和完整大分子插入片段回收。我公司负责人、华中农业大学罗美中教授的课题组（杨学等未发表资料）在pMSBBACs 载体的基础上，引入了超稀有的归位内切酶I-SceⅠ，得到高拷贝的链霉菌整合BAC载体pHZAUBAC-AS。用pHZAUBAC-AS载体构建的放线菌基因组BAC文库，能够简单而又精确地鉴定外源插入片段大小、回收得到完整的基因簇序列和鉴定文库质量，同时能够结合最新的测序技术，开展高通量末端测序工作。

利用pHZAUBAC-AS载体的多重优点，采用多组学分析法与LEXAS文库异源表达和功能筛选方法相结合的策略，能够极大地提高活性天然产物的挖掘速度和复杂结构天然产物的生物合成效率。

放线菌BAC文库的构建


Figure 4. 阿维链霉菌BAC文库的平均插入片段检测PFGE胶图(刘家栋 et al. 2016)。

“定向合成代谢”（Targeted Anabolism）理论技术体系


Figure 5. Omics guided systematically natural product synthetic pathway refactoring for yield improvement(Gao. Yi. Tan and Tiangang. Liu 2017).

“定向合成代谢”（Targeted Anabolism）是武汉大学药学院邓子新院士团队刘天罡教授首先提出来的理论技术（图5）。这一新策略的提出使得萜类骨架化合物及其生物合成元件的挖掘速度取得了突破性的进展，可以在很大程度上避免对已知化合物的重复挖掘。同时也使得人们对萜类合酶生物合成能力的认识提升到一个新的高度，具有广泛的应用性。相关研究成果在代谢工程领域顶级期刊 Metabolic Engineering《代谢工程》在线发表：《高效的萜类化合物底物供给平台助力释放萜类环化酶生物合成潜力》（Releasing the potential power of terpene synthases by a robust precursor supply platform）(Gao. Yi. Tan and Tiangang. Liu 2017)。

参考文献：

  1. Deng Qian, Zhou Li, Luo Meizhong, Deng Zixin, Zhao Changming. 2017. Heterologous expression of Avermectins biosynthetic gene cluster by construction of a Bacterial Artificial Chromosome library of the producers. Synthetic and Systems Biotechnology 2(1): 59-64.
  2. Feng Zhiyang., Wang Liyan., Rajski Scott. R., Xu Zhinan., Coeffet-LeGal Marie. F., Shen Ben. 2009. Engineered production of iso-migrastatin in heterologous Streptomyces hosts. Bioorganic & medicinal chemistry 17(6): 2147-2153.
  3. Jones Adam. C., Gust Bertolt., Kulik Andreas., Heide Lutz., Buttner Mark. J., Bibb Mervyn. J. 2013. Phage p1-derived artificial chromosomes facilitate heterologous expression of the FK506 gene cluster. PloS one 8(7): e69319.
  4. Li Li., Xu Zhinan., Xu Xiaoying., Wu Jun., Zhang Yun., He Xinyi., Zabriskie T. Mark., Deng Zixin. 2008. The mildiomycin biosynthesis: initial steps for sequential generation of 5-hydroxymethylcytidine 5'-monophosphate and 5-hydroxymethylcytosine in Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119. Chembiochem : a European journal of chemical biology 9(8): 1286-1294.
  5. Luo Meizhong, Wing Rod A. 2003. An Improved Method for Plant BAC Library Construction. Methods in Molecular Biology 236: 3-20.
  6. Shi Xue., Zeng Haiyang., Xue Yadong., Luo Meizhong. 2011. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant methods 7: 33.
  7. Tan Gao. Yi., Deng Kunhua., Liu Xinhua., Tao Hui., Chang Yingying., Chen Jia., Chen Kai., Sheng Zhi., Deng Zixin., Liu Tiangang. 2017. Heterologous Biosynthesis of Spinosad: An Omics-Guided Large Polyketide Synthase Gene Cluster Reconstitution in Streptomyces. ACS synthetic biology.
  8. Tan Gao. Yi., Liu Tiangang. 2017. Rational synthetic pathway refactoring of natural products biosynthesis in actinobacteria. Metabolic engineering 39: 228-236.
  9. Wang Shan., Zhao Ruifang., Liu Kai., Zhu Mengyi., Li Aiying., He Jing. 2012. Essential role of an unknown gene aziU3 in the production of antitumor antibiotic azinomycin B verified by utilizing optimized genetic manipulation systems for Streptomyces sahachiroi. FEMS microbiology letters 337(2): 147-154.
  10. Xu Min., Wang Yemin., Zhao Zhilong., Gao Guixi., Huang Sheng. Xiong., Kang Qianjin., He Xinyi., Lin Shuangjun., Pang Xinhua., Deng Zixin. et al. 2016. Functional Genome Mining for Metabolites Encoded by Large Gene Clusters through Heterologous Expression of a Whole-Genome Bacterial Artificial Chromosome Library in Streptomyces spp. Applied and environmental microbiology 82(19): 5795-5805.
  11. 郭航, 白亭丽, 陶美凤. 2012. 刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装. 华中农业大学学报 31(3): 298-302.
  12. 黄胜, 李娜, 周俊, 何璟. 2012. 适用于链霉菌大片段基因组DNA克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用. 微生物学报 52(1): 30-37.
  13. 李娜, 黄胜, 何璟. 2015. 链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆. 华中农业大学学报 34(4): 73-79.
  14. 刘家栋, 王革娇, 罗美中. 2016. 阿维链霉菌BAC文库的构建及分析. 华中农业大学学报 35(5): 45-50.
  15. 张怡, 鲁洲, 黄胜, 何璟. 2015. 链霉菌SH-62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达. 华中农业大学学报 34(6): 55-60.